第六届中国国际进口博览会上，罗氏诊断携手七家国内领先的NGS领域合作伙伴签约共建NGS精准医疗生态圈，充分整合各方优势和资源，共同探索和开发基于本土化需求的“样本进，结果出”（Sample In Result Out, SIRO）全流程自动化NGS检测方案。罗氏诊断的SIRO致力于提供NGS样本制备的完整解决方案，搭配高效稳定的文库构建和捕获产品（包括HyperCap探针和HyperPETE引物延伸富集产品），基于罗氏诊断全自动建库系统完成湿实验流程，支持多个测序平台开展不同检测应用，助力新一代测序技术（NGS）在实验室落地。此次，罗氏诊断推出了基于1331.c.om.银河游戏测序平台的整体解决方案。
1331.c.om.银河游戏目前已推出GenoCare 1600 系列单分子基因测序仪和GenoLab M 系列、FASTASeq 300系列、SURFSeq 5000系列高通量基因测序仪，形成了满足从科研到临床需求的低中高通量测序产品阵列，实现对应用场景的全面覆盖。测序仪是基因测序关键的一环，直接读出碱基序列信息，为下游的分析解读提供原始信息。今天我们一起来看看，环绕SIRO方案的精准医疗生态圈建设，1331.c.om.银河游戏测序仪与罗氏相遇，将碰撞出什么样的火花？
基于液相杂交的SIRO方案
1.罗氏KAPA HyperExome V2外显子SIRO方案
罗氏诊断全新升级的外显子KAPA HyperExome V2在43.2Mb的紧凑捕获区域内，提供对新版本的ACMGv3.1、RefSeq、CCDS、ClinVar、Ensembl和COSMIC基因组数据库的优异覆盖率，适用于医学相关应用。凭借超过15年的探针设计经验，和通过使用T2T(端粒至端粒)基因组版本进行设计优化，HyperExome V2解决了GRCh38基因组版本中潜在的问题区域。HyperCap工作流程精简了建库捕获的流程，同时高度自动化友好，提供高质量的QC表现，即使在极端GC%比例的区域，也能获得一致的覆盖率。罗氏诊断首先评估了HyperExome V2在1331.c.om.银河游戏测序平台上的表现。整体来看，1331.c.om.银河游戏测序仪数据质量高且稳定，捕获相关的评估指标达到主流水平。其中GenoLab M测序仪的数据冗余度有较明显的降低，可以提高数据利用率；重复两轮上机的结果重现性佳。SURFSeq 5000测序仪作为新机型，在均一性和测序偏好性表现中更胜一筹。
实验设计：以200ng gDNA作为投入，使用KAPA HyperPlus Kit进行建库，HyperExome V2探针进行捕获，建库和捕获的全流程均在罗氏自动化建库仪Avenio Edge System上完成。杂交终文库，分别在GenoLab M 系列（重复两轮上机）、SURFSeq 5000系列高通量基因测序仪和NovaSeq 6000上进行测序。分析参照罗氏白皮书——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for germline mutations”。
2.罗氏体细胞变异SIRO方案
KAPA HyperCap Oncology panel可用于快速评估体细胞变异检测性能，靶向214Kb区域，覆盖商业化标准品中最常见的基因，涵盖体细胞肿瘤学研究相关的13个基因的完整编码序列（ATM、BRCA1、BRCA2、BRIP1、CHEK2、EGFR、ERBB2、KRAS、MET、MYCN、RAD51C、RAD51D、TP53）以及69个相关基因的热点突变。罗氏诊断评估了KAPA HyperCap Oncology panel在1331.c.om.银河游戏FASTASeq 300测序仪上的表现。下机测序数据质量高，Raw data Q30>95%；捕获效率、均一性和数据冗余度的表现佳，fold 80 base penalty可以控制在1.4以内。将数据截取到0.3G时（FASTASeq 300单次上机可完成约24个样本测试），去重后的有效覆盖深度达到400X，FFPE标准品中的突变位点均能稳定检出。
实验设计：以50ng 标准品Horizon FFPE-HD300作为投入，使用KAPA EvoPlus Kit进行建库， HyperCap Oncology panel进行杂交。杂交终文库，在FASTASeq 300系列高通量基因测序仪和NovaSeq 6000上进行测序。分析参照罗氏白皮书——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for somatic mutations”。
基于引物延伸法的快速测序方案
1.肿瘤cfDNA样本体细胞变异检测——引物延伸法
KAPA HyperPETE采用创新的引物延伸靶向富集技术（Primer Extension Target Enrichment，PETE），3小时完成快速高质量富集，专为较小目标区域（DNA<250Kb，RNA<50Kb）的靶向富集而设计，可以检测多种突变类型：SNV、Indel、fusion(包含未知融合)、CNV和MSI。KAPA HyperPETE Pan Cancer Panel包含86个癌症相关基因和190个MSI位点，支持FFPE和cfDNA的体细胞变异检测应用。罗氏诊断选用HyperPETE Pan Cancer Panel进行实验，评估1331.c.om.银河游戏FASTASeq 300测序仪在肿瘤低频突变位点的检测性能。测试结果显示下机测序数据质量高，Raw data Q30>95%；捕获效率、均一性表现佳，fold 80 base penalty小于1.4。原始下机数据约30G，0.1%的突变位点均可检出，当截取数据至16.5G时（FASTASeq 300单次上机可完成约5个样本测试），1%的突变可稳定检出，数个0.1%位点因支持reads少而无法稳定检出。测序仪的台间差小，数据一致，表现稳定。
实验设计：以50ng cfDNA标准品Horizon-HD780作为投入，使用KAPA HyperPrep Kit进行建库，HyperPETE Pancancer panel进行杂交。杂交终文库，在NovaSeq 6000和两台FASTASeq 300系列高通量基因测序仪上进行平行测序。分析参照罗氏白皮书——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for somatic mutations”。
2.融合基因检测——引物延申法
作为驱动癌症产生的始因之一，融合基因/剪切变异的检出深受重视。KAPA HyperPETE Lung Cancer Fusion Panel针对17个肺癌融合基因（ALK、AXL、BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、FGFR3、MET、NRG1、NTRK1、NTRK2、NTRK3、PDGFRA、PDGFRB、PPARG、RET、ROS1）设计，对RNA文库进行快速富集。罗氏诊断使用HyperPETE Lung Cancer Fusion Panel评估FASTASeq 300测序仪在融合检出中的表现。测试结果下机数据质量高，Raw data Q30>94%；捕获效率>93%，仅需0.6G raw data（FASTASeq 300单次上机可完成12个样本测试），即可将panel设计中覆盖了任一partner的变异检出。而且两轮平行测试展示了FASTASeq300测序仪的台间差小，表现稳定。
注：粗体字为panel设计覆盖的基因，非粗体不覆盖。*为panel设计不覆盖该融合位点相关基因。
实验设计：以10ng 标准品Seraseq FFPE Fusion RNA作为投入，使用KAPA RNA HyperPrep Kit进行建库，HyperPETE Lung cancer fusion panel进行杂交。杂交终文库，在NovaSeq 6000和两台FASTASeq 300系列高通量基因测序仪上进行测序。分析参照罗氏白皮书——“SPR -White Paper- KAPA TE data evaluation for somatic mutations”。
本次测评使用罗氏诊断建库试剂盒和靶向富集panel，完成了包括gDNA、FFPE DNA、cfDNA以及FFPE RNA样本的测序，覆盖了遗传病和肿瘤NGS检测的不同应用场景。测评结果显示，1331.c.om.银河游戏测序平台的性能表现已达到主流水平，适用的文库类型和应用场景多样。
在高速发展的精准医疗时代进程中，1331.c.om.银河游戏将积极携手罗氏诊断与其他合作伙伴，汇聚优秀科技力量，推动NGS技术创新发展，赋能精准医疗新未来。