近日，湖州学院生命科学学院浙江省水产资源保护与开发重点实验室在 （Aquaculture IF 4.5）发表题为“Changes in molting frequency and expression patterns of molting-related genes in Macrobrachium rosenbergii with exogenous calcium supplement in water ”的研究成果。为研究外源补钙对罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)脱皮的影响，该研究采用25 mg/L、85 mg/L、145 mg/L和205 mg/L梯度钙浓度的水对罗氏沼虾进行培养试验。结果表明，145 mg/L浓度组的累积脱皮率最高。145 mg/L浓度组在脱皮前和脱皮后均表现出较高的脱皮相关酶(谷氨酰胺合成酶、β- n -乙酰氨基葡萄糖酶和几丁质酶)活性。145 mg/L组与对照组相比，外骨骼外表皮密度增大，鞘内增厚，上皮细胞形态呈柱状;基于GenoLab M高通量测序平台的转录组测序结果显示，一些差异基因在溶酶体和钙信号等通路中显著富集。同时，145 mg/L剂量组脱皮相关基因维甲酸X受体、蜕皮激素受体、钙调磷酸酶等基因的表达水平显著升高。在205 mg/L浓度下，罗氏沼虾Na+/K+ ATP酶α亚基的表达受到抑制，影响其蜕皮。综上所述，在水中适量补充钙可以促进罗氏沼虾的蜕皮和外骨骼矿化。该研究为甲壳类水产养殖中外源补钙提供了理论依据。
蜕皮是甲壳类海洋生物生命周期中重要的生理过程，对甲壳类海洋生物的生长发育、繁殖和肢体再生具有重要作用。这一过程的特点是一系列形态学变化，主要包括蜕皮期间(C)、蜕皮前(D)、蜕皮(E)和蜕皮后(AB)阶段。甲壳类动物的外骨骼主要由碳酸钙组成，钙的来源是食物、水和体内储存。然而，饲料中的钙含量不能满足甲壳类动物蜕皮的需要。因此，在水中添加外源钙已成为甲壳类水产养殖的普遍做法。人们普遍认为，在水中适量补充外源钙可以促进甲壳类脱壳。但目前外源钙补充对甲壳类动物蜕皮影响的分子机制尚不清楚。
01 转录组揭示不同钙浓度下肝胰脏基因表达
为了阐明不同钙浓度下罗氏沼虾换壳的遗传调控机制，该研究对罗氏沼虾肝胰腺样本进行了RNA-seq分析。差异分析表明， 145 mg/L组大多数差异基因上调(图1B)。145 mg/L组 VS 25 mg/L组、85 mg/L组 VS 145 mg/L组中鉴定的差异基因数量大约是85 mg/L组 VS 25 mg/L组、205 mg/L组 VS 25 mg/L组、145 mg/L组 VS 205 mg/L组比较中鉴定的差异基因数量的2倍(图1C)。在5个比较组中，共有18、19、17、24和22个KEGG通路被显著富集，如MAPK信号通路(ko04010)和Wnt信号通路(ko04310)。代谢途径(ko01100)是两两比较中检测到的共有通路，除145 mg/L组和205 mg/L组比较外，4组均检测到溶酶体信号通路。有趣的是，钙信号通路(ko04020)和溶酶体通路(ko04142)在85 mg/L组和145 mg/L组的比较中被显著富集(图1D)，钙信号通路在205 mg/L组和25 mg/L组的比较中也被显著富集。
图1 两两比较罗氏沼虾4组间差异表达基因的数量
02 转录组揭示外源补钙对虾蜕皮调控关键基因
为了进一步筛选出蜕皮调控的关键候选基因，该研究对溶酶体和钙信号通路中的差异基因进行了筛选和聚类(图2A)。聚类分析表明，145 mg/L组与其他组相比具有特定的基因表达模式，205 mg/L组的基因表达趋势与对照组相似。145 mg/L组鞘磷脂磷酸二酯酶、组织蛋白酶D、组织蛋白酶L、组织蛋白酶B单钙转运蛋白和腺嘌呤核苷酸转位酶等基因的表达水平在中上调，而外源性类固醇调节样蛋白的表达受到抑制。溶酶体途径中的ERP抑制蜕皮激素的产生。此外，鞘磷脂磷酸二酯酶、组织蛋白酶D、组织蛋白酶L、组织蛋白酶B等基因位于溶酶体通路的关键节点，其表达水平上调会调节溶酶体中的钙通道(图3)。
为了揭示4组的基因表达动态，使用TCseq对所有差异进行表达趋势分析，并根据4组的基因表达趋势选择两个聚类(图3B)。聚类1显示1461个差异基因聚集在一起，145 mg/ L组基因表达量最高。KEGG富集分析表明，差异基因在“氧化磷酸化”(ko00190)中显著富集。随着钙浓度的升高，簇2整体呈上升趋势。KEGG富集分析显示，基因主要富集于“Rap1信号通路”(ko04015)和“FoxO信号通路”(ko04068)。
图3 参与溶酶体和钙信号通路的差异基因热图
1. 本文研究了不同钙浓度水中罗氏沼虾蜕皮频率、蜕皮相关酶、外骨骼矿化和转录调控的变化。研究发现，适量的外源补钙可以促进罗氏沼虾的蜕皮和外骨骼矿化；
2. RNA-seq分析表明，适当的钙浓度可抑制蜕皮抑制激素（MIH）和 fushitarazu factor 1 (ftz-f1) 的表达水平，从而介导MIH信号通路下游基因的表达，影响罗氏沼虾的蜕皮过程；
3. 水中钙含量过高会抑制ATPase alpha subunit (atpa) 的表达，影响罗氏沼虾的蜕皮。这些发现有助于理解钙调控罗氏沼虾蜕皮的分子机制。
Ding, Li, et al. "Changes in molting frequency and expression patterns of molting-related genes in Macrobrachium rosenbergii with exogenous calcium supplement in water." Aquaculture 586 (2024): 740761.